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Western Blot中如何選擇內參抗體


發布日期:[2019-02-27] 共閱[287]次

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    Western Blot
    Western Blot即免疫印跡試驗,可以利用Western Blot來比較在不同條件下,不同細胞組織中目的蛋白表達量的差異,屬于定性,半定量試驗。既然有差異性比較,參照物必不可少。Western Blot試驗中的標準(表達量)參照物即內參,有了參照物才能準確地比較目的蛋白表達量的差異。內參一般選用管家基因表達的蛋白,它們在各個組織細胞中表達相對恒定,不會因為外部條件變化而引起表達量的變化。而且內參可以監測整個試驗體系是否正常,比如蛋白提取過程,轉膜體系,顯色體系等。beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等已作為成熟的內參運用到試驗中,下面就大致介紹下如何選擇內參:

    樣本來源

    1.哺乳動物的組織或細胞主要以 beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 為代表。

    2.植物樣本主要以 actin、Rubisco 為代表。

    目的蛋白定位

    1.全細胞蛋白和細胞質:beta Actin、beta Tubulin、GAPDH等

    2.細胞核蛋白: PCNA等

    3.核膜蛋白:Lamin B1等

    4.胞膜蛋白:Na(+)/K(+) ATPase等

    目的蛋白分子量

    beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 的分子量分別是 42kd,50kd,37kd,目的蛋白分子量zui好能與內參蛋白分子量相差 5kd 以上,才能分開目的蛋白和內參,寫文章做圖也更美觀。

    三大內參

    beta Actin,肌動蛋白,細胞骨架蛋白。它們在各組織和細胞中的表達相對恒定,在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。beta Actin 作為內參是得到公認的,針對大多數組織和細胞來說的,它廣泛分布于細胞質內,表達量非常豐富。但是在一些少量特殊的情況下比如脂肪組織和細胞內,beta Actin 的表達量就很少。

    GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫氫酶,該酶是糖酵解反應中的一個酶,幾乎在所有組織細胞中都高水平表達,在同種細胞或組織中的表達量一般是恒定的,且很少受外部誘導物的影響。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下,會增加 GAPDH 在特定細胞和組織中的表達。

    beta Tubulin,微管蛋白,細胞骨架蛋白。作為內參抗體,beta Tubulin 表達通常不會發生改變,因此被廣泛用于 Western Blot 內參,也常被用于免疫染色觀察細胞的微管結構。

    下面是多年項目經理在開發抗體時的一點心得,希望對大家有幫助。

    1.不同的內參在選擇上也要根據具體的樣本情況選擇,沒有一種內參能適用所有的組織和細胞樣本。比如,血紅細胞(因為其細胞結構的特殊性和需要攜帶氧氣的功能性)樣本就不適合以上 3 種常用內參。如果使用會導致結果很差或者沒有結果??梢匝∮醚煜赴慕峁剮緣鞍鬃魑誆未?。

    2.在做多組織多細胞樣本對比表達量時,zui好選用 GAPDH 作為內參,因為 GAPDH 是代謝類蛋白,在活組織中表達比較恒定。而 beta Actin 和 beta Tubulin 是結構蛋白,不同組織的細胞結構會有差異性,如腦組織的 tubulin 的表達會高一些(因為神經細胞的軸突和樹突都由 tubulin 維持結構),而 actin 的表達量可能會低一些。再比如,骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而導致了 tubulin 的表達改變和特化。心肌的 beta Actin 的表達量可能變少,而 alpha Actin 表達量高。因為這些組織的差異,現在慢慢采用總 Actin 和總 tubulin 作為內參,可以盡量減少一些組織表達量差異。

    3.做各種分泌液樣本的時候,如血漿,乳汁,組織液等,以上的 3 種內參也不是很合適。由于沒有完整的細胞結構,所以只能選擇一些分泌蛋白作為內參,或者采用其他方式作為內參。

    4.做誘導后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時,選擇結構蛋白作為內參,如 beta Actin 和 beta Tubulin。因為 GAPDH 是代謝類蛋白,表達量有可能會受到誘導處理的影響。同時,做修飾性抗體的 Western Blot 實驗,zui好也帶上同抗原的總抗作為陽性對照。

    5.做Western Blot實驗時,內參的條帶強度也要適當控制。不要讓內參條帶發生過度曝光的情況,尤其是用 X 膠片曝光的。如果內參條帶過度曝光,條帶會顯得很寬,妨礙對條帶正確強度的判讀,進而影響對其他實驗結果的判斷。zui好的內參結果是:窄窄的,黑色實心條帶。

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